El aislamiento de C. trachomatis en cultivo celular o la identificación de C. trachomatis mediante ensayos de fluorescencia directa (DFA) se pueden utilizar para el diagnóstico de infecciones agudas solo en el caso de que los NAAT de C. trachomatis no estén disponibles o cuando no son accesibles. Se recomienda el uso de NAAT validados y de calidad garantizada debido a su mayor sensibilidad, especificidad y velocidad en el diagnóstico de infecciones sintomáticas y asintomáticas, en comparación con todas las demás técnicas de diagnóstico15,16. Debido a la alta especificidad de los NAAT validados para la C. trachomatis, y al hecho de que cuando se repiten las pruebas existe un riesgo de perder algún resultado positivo débil, no se recomienda la realización de pruebas confirmatorias de las muestras que hayan resultado positivas17,18. Una excepción importante a tener cuenta es cuando se realizan investigaciones judiciales en el caso de sospecha de una agresión sexual.

Los NAAT pueden usar muestras recogidas de forma poco invasiva, como son las muestras de orina en hombres, hisopos vulvovaginales en mujeres e hisopos anorrectales en ambos sexos19. Se puede incrementar la sensibilidad diagnóstica utilizando esferas de partículas magnéticas recubiertas, con lo que los ácidos nucleicos se aislarán en mayor cantidad y calidad20. Estos sistemas de extracción basados en el uso de esferas se pueden automatizar y utilizar en diversos sistemas de alto rendimiento, lo que permite la realización de pruebas simultáneas de clamidia y gonococos con adecuada sensibilidad y especificidad20. Para incrementar la sensibilidad de la técnica, estas pruebas se basan en la detección de genes presentes en un gran número de copias (plásmido críptico X06707 [10 copias/genoma] o 16S ADNr [2 copias/genoma])21.

En aquellos estudios donde se ha buscado comparar ambos métodos, los NAAT han detectado entre un 10 y un 30% más de muestras positivas de C. trachomatis que en los estudios que comparan los dos métodos22,23. En otros estudios, los resultados obtenidos a partir de diferentes NAAT mostraron ser altamente concordantes24,25. La importancia de las variaciones genéticas se hizo evidente con la aparición de la variante sueca, la cual no fue detectada por algunos NAAT comercializados debido a la deleción en la región diana de estas pruebas26. La implementación de una segunda región diana en los NAAT representa una mejora importante, permitiendo la detección de nuevas variantes que tengan deleciones o recombinación en una de las regiones diana27. Como ejemplo de sistemas que desarrollaron una modificación de la técnica tenemos al Cobas Taqman CT/NG v 2.0 (Roche) y al Artus C. trachomatis plus RG Kit PCR (Qiagen). Una limitación de todas estas técnicas de diagnóstico es la falta de discriminación entre los diferentes biovares de C. trachomatis relacionados con diferentes procesos patológicos que pueden detectarse en muestras uretrales o cervicales. Ninguna de las técnicas anteriores puede discriminar entre los serotipos D-K y los serotipos L1-L3 relacionados con el linfogranuloma venéreo21.

Las pruebas rápidas en el punto de atención proporcionan un resultado rápido y fácil, y permitirán que el diagnóstico y el tratamiento posterior se puedan realizar en la misma visita en la clínica o incluso en modo remoto. La mayoría de las POCT son pruebas cromatográficas inmunes basadas en una tecnología de flujo lateral y que detectan el antígeno lipopolisacárido de la clamidia (LPS), tanto en hisopos genitales como en orina. En comparación con el cultivo y los NAAT, estas POCT basadas en antígenos son significativamente menos sensibles y específicas. Las POCT basadas en antígenos no se han recomendado para la prueba de C. trachomatis, tanto en la detección precoz de pacientes asintomáticos como en la de los pacientes sintomáticos28. Se han desarrollado POCT con mayor sensibilidad y nuevos NAAT de POCT (p.ej., el ensayo Xpert de Cepheid CT/NG). Este estudio se basa en el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real realizada en un sistema cerrado. Después de haber colocado la muestra clínica en un cartucho, los pasos subsiguientes de aislamiento de ácido nucleico, amplificación y detección de productos de PCR continúan un proceso completamente automatizado. Otras POCT de NAAT comercializadas utilizan tecnología de amplificación isotérmica, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) o por la amplificación mediante recombinasa polimerasa (RPA)29.

La prueba de anticuerpos contra C. trachomatis no es útil para diagnosticar la infección local del epitelio del tracto genital inferior, ya que los anticuerpos solo se detectarán tras varias semanas, los títulos de anticuerpos pueden ser bajos y muchas pruebas serológicas no podrán diferenciar los anticuerpos de diferentes especies de clamidias.

La prueba de microinmunofluorescencia (MIF) se consideraba el método de referencia para el estudio de los anticuerpos contra clamidia durante mucho tiempo, pero los inmunoensayos enzimáticos (EIA) y los inmunoblots o inmunoensayos en línea se usan actualmente con mayor frecuencia en la detección de infecciones por clamidia30,31. La tecnología de los EIA se basa en la detección del antígeno mediante la medición de una señal coloreada generada por los lipopolisacáridos de reacción antigénica (LPS) con el anticuerpo. Tradicionalmente han gozado de gran popularidad por ser técnicas simples, objetivas y automatizadas. La especificidad del EIA es baja, pudiendo dar falsos positivos debido a la presencia de lipopolisacáridos bacterianos (LPS). Otras técnicas se basarán en la tinción directa de muestras con anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína (DFA). Esta última técnica utiliza anticuerpos específicos de la especie dirigidos principalmente contra la proteína principal de la membrana externa (MOMP) del antígeno y, en menor medida, contra el LPS. Las principales ventajas de las técnicas de DFA son su velocidad (30min) y su especificidad cercana al 100%, la sensibilidad es del 85-90%, y en comparación con el cultivo no requieren medios de transporte específicos. Entre sus inconvenientes están la interpretación subjetiva, el requerir personal experimentado, el presentar una baja reproducibilidad y, por último, el volumen de muestras no debe ser elevado.

Hasta finales del siglo XX, el cultivo celular fue el estándar de referencia con el que se han comparado todas las demás pruebas diagnósticas. Sin embargo, principalmente debido a la aparición de nuevos métodos de diagnóstico, que son más fáciles de implementar, así como rápidos y sensibles, el cultivo celular ha sido relegado sobre todo a los laboratorios de referencia. Las líneas celulares establecidas para el aislamiento de C. trachomatis incluyen la McCoy, Hela 2921. Las muestras para el cultivo deben recogerse utilizando dispositivos y medios de transporte especiales. La sensibilidad del cultivo puede verse afectada por la recolección, el almacenamiento y el transporte inadecuados de las muestras, las sustancias tóxicas en las muestras clínicas y el crecimiento excesivo de cultivos celulares por bacterias y hongos comensales. El cultivo celular es una técnica muy específica, sin embargo, la sensibilidad no es muy buena (75-80%)21,32.

La NG se puede visualizar microscópicamente mediante la tinción de un frotis obtenido del tracto genital de los pacientes sintomáticos. En hombres con secreción uretral, se puede usar la microscopia (×1.000) de la tinción de Gram para identificar diplococos dentro de los leucocitos polimorfonucleares, con una buena sensibilidad (≥95%) y especificidad (≥99%), como prueba diagnóstica rápida36. Sin embargo, en hombres asintomáticos esta técnica tiene poca sensibilidad (≤55%), así como en la identificación de la infección endocervical o rectal (≤55% y ≤40%, respectivamente), por lo que, en estas circunstancias, no se puede recomendar el uso de la microscopia como prueba para descartar una infección. Además, las tinciones de Gram de muestras endocervicales, rectales o faríngeas no se recomiendan para la detección de infecciones debido a la poca especificidad y a la baja sensibilidad.

El cultivo es el único método diagnóstico que permite realizar pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos, por lo que sigue siendo importante para detectar y controlar la resistencia a estos. Las muestras deben obtenerse utilizando hisopos que no contengan compuestos como la madera y el algodón, ya que estos pueden ser inhibidores o tóxicos para la NG. Algunos sistemas de transporte pueden mantener la viabilidad del gonococo hasta 48h a temperatura ambiente37. Los hisopos se deben insertar 2-3cm en la uretra masculina o 1-2cm en el canal endocervical, y luego se realizarán 2-3 rotaciones.

Las muestras obtenidas de localizaciones estériles se pueden cultivar en un medio no selectivo (p.ej., Agar chocolate), mientras que las de localizaciones no estériles se cultivarán en un medio selectivo (p.ej., Martin-Lewis, Thayer-Martin)38, el cual contiene agentes antimicrobianos que inhibirán el crecimiento de otras bacterias y hongos. Estos medios se incuban a 35°C en un ambiente suplementado con el 5% de CO2 y se valorarán al menos durante 48-72h. Los diplococos gramnegativos y las colonias oxidasa positivas presumiblemente se pueden identificar como NG. Sin embargo, se necesitarán pruebas bioquímicas adicionales para poder confirmar el diagnóstico.

Se deberá realizar un cultivo para el estudio de la sensibilidad antimicrobiana en aquellos pacientes con una infección persistente o si se sospecha un fracaso del tratamiento. Además, la caracterización de estos mediante una tipificación molecular puede ser una herramienta útil para predecir la resistencia a los antimicrobianos, ya que algunos tipos estarán asociados a una menor susceptibilidad a diversos antibióticos39. La sensibilidad del cultivo es elevada en las muestras genitales, pero dependerá en gran medida de la forma de recolección de las muestras, del transporte, del almacenamiento y de los procedimientos de aislamiento.

Las técnicas de NAAT se recomiendan para la detección de infecciones causadas por la NG con y sin síntomas. Los NAAT son más sensibles que el cultivo, se pueden usar en una gama más amplia de tipos de muestras, y la calidad, el transporte y el almacenamiento de las muestras son menos estrictos40–43. Los NAAT son la prueba de elección para valorar pacientes que estén asintomáticos40. Estas técnicas tendrán una sensibilidad similar en las muestras de orina y en las de la uretra de los hombres43, así como una sensibilidad similar en las muestras endocervicales tomadas por médicos y en aquellas tomadas por los mismos pacientes44. Sin embargo, en las mujeres, las muestras de orina tendrán una menor sensibilidad que las muestras obtenidas con hisopos genitales45. Además, los NAAT serán significativamente más sensibles que el cultivo para la detección de la NG en las muestras faríngeas y rectales46,47, por lo que son las pruebas de elección para el cribado de este tipo de infecciones. Sin embargo, estas técnicas no se han aprobado para el estudio de las muestras de estas localizaciones. En la guía actualizada norteamericana para el diagnóstico de estas infecciones se puede encontrar un resumen de las plataformas de análisis NAAT disponibles en el mercado y que han sido aprobadas por la Food and Drug Administration (FDA) para la detección de NG en los Estados Unidos32.

El examen de LCR en un paciente con signos y síntomas neurológicos debe incluir proteínas totales, el número de células mononucleares y una prueba serológica. Las alteraciones del LCR (pleocitosis y una mayor concentración de proteínas) son comunes en personas con neurosífilis. CSF-VDRL es altamente específico pero insensible (se observa una prueba positiva de CSF-VDRL en solo alrededor de 1:3 casos de neurosífilis). No se recomienda la prueba rápida de reagina plasmática en el LCR48.

En una persona con signos o síntomas neurológicos, un CSF-VDRL reactivo (en ausencia de contaminación sanguínea) se considera diagnóstico de neurosífilis. Cuando el CSF-VDRL es negativo, pero existen signos clínicos de neurosífilis y un recuento anormal de células y/o proteínas del CSF, se debe considerar el diagnóstico de una neurosífilis.

La prueba CSF FTA-ABS es menos específica para la neurosífilis que la CSF-VDRL, pero es muy sensible. En pacientes con sospecha de neurosífilis pero con un VDRL de LCR negativo, se puede usar una prueba de FTA-ABS de LCR para descartar una neurosífilis48.

Debido a que los anticuerpos maternos no treponémicos y treponémicos IgG pueden transferirse de madre a hijo, no se recomiendan las pruebas treponémicas séricas del neonato. Un aumento de 4 veces o más del título de un NTT en el suero del niño en comparación con el suero de la madre (ambos obtenidos simultáneamente al nacer) es altamente sugestivo de sífilis congénita, pero su ausencia no excluye el diagnóstico52. En niños en quienes la madre presenta una prueba treponémica positiva y cualquier evidencia de sífilis congénita en el examen físico, o con una radiografía de huesos largos sugestiva, o que presentan un análisis de CSD VDRL reactivo, o una elevación del recuento celular o de proteínas a nivel del LCR (sin otra causa aparente), se puede sugerir el diagnóstico de sífilis congénita52.

El diagnóstico de tricomoniasis se basa comúnmente en un examen microscópico de preparaciones en fresco de descargas vaginales y uretrales, secreciones prostáticas y sedimento de orina. Las muestras deben mezclarse con una gota de solución salina fisiológica (pero nunca refrigerarse) y examinarse microscópicamente dentro de 1h a baja potencia (aumento ×100), con iluminación reducida. La presencia de tricomonas activamente móviles es diagnóstica de la infección60. Las células polimorfonucleares a menudo están presentes en estas preparaciones. Sin embargo, aunque esta técnica es rápida y económica, la sensibilidad es del 50-70% y puede ser menor en mujeres asintomáticas. El factor más importante que afecta la sensibilidad de las pruebas de «montaje húmedo» es el tiempo entre la recolección y el examen de la muestra.

El cultivo de fluidos genitales se ha considerado la prueba estándar en el diagnóstico, aunque requiere una incubación de 18-24h. La sensibilidad del cultivo es superior al 80% en comparación con el del frotis vaginal. El medio de transporte Amies Agar Gel podría mantener la viabilidad del cultivo de TV en torundas mantenidas a temperatura ambiente durante 24±6h antes de la inoculación de la muestra en una bolsa de cultivo. Sin embargo, la mejor práctica es que las muestras se recojan adecuadamente y se inoculen inmediatamente en el medio apropiado, como el medio modificado de Diamond, Trichosel o Holander. Los sistemas de cultivo o los sistemas que permiten la inoculación directa, el transporte, el cultivo y el examen microscópico están disponibles comercialmente61.

Se han desarrollado diversos métodos de detección de antígenos, siendo la principal ventaja que son rápidos y fáciles de realizar. La prueba de aglutinación de látex ha demostrado una excelente sensibilidad62. Comercialmente está disponible una prueba de flujo capilar inmunocromatográfico para la detección cualitativa de antígenos de TV en hisopos vaginales63,64. El kit de prueba rápida OSOM Trichomonas es un estudio con tiras reactivas que proporcionan resultados en 10min. Esta prueba ha demostrado una buena sensibilidad y especificidad en comparación con otros métodos de diagnóstico65. Se ha desarrollado una prueba rápida para la detección de la TV. Esta prueba usa una novedosa detección electroquímica utilizando una región de múltiples copias del genoma de la TV como diana del análisis. La sensibilidad y la especificidad logradas al usar este método son comparables con las obtenidas con la prueba NAAT66.

Affirm VPIII es una prueba de hibridación de ácidos nucleicos que utiliza sondas sintéticas de captura de los ácidos nucleicos y sondas de detección de desarrollo de color67.

El ensayo AmpliVue utiliza la amplificación isotérmica dependiente de la helicasa (HDA) y tiene como diana una secuencia repetida de ADN conservada de la TV68. Esta técnica ha sido aprobada recientemente por la FDA para su uso en hisopos vaginales. Por otro lado, la prueba Solana para Trichomonas es un NAAT cualitativo in vitro para la detección de TV que también utiliza la tecnología HDA y la herramienta Solana69. Recientemente fue aprobado por la FDA. En comparación con un ensayo NAAT, la sensibilidad/especificidad fue del 89,7/99,0% para muestras tomadas con hisopos y del 100/98,9% en muestras de orina.

Finalmente, el ensayo GeneXpert TV ha sido aprobado por la FDA para su uso en muestras de orina de pacientes varones.

Estas técnicas están ahora disponibles comercialmente para el diagnóstico de TV en mujeres y han reemplazado al cultivo como la prueba estándar debido a su excelente sensibilidad y especificidad. Las tomas genitales y de orina son muestras aceptables70. A pesar de que la FDA no ha aprobado los NAAT en pacientes de sexo masculino, estas técnicas han demostrado una alta sensibilidad y especificidad en esta población. Entre las mujeres, los NAAT pueden detectar una prevalencia de 3 a 5 veces mayor que la microscopia de muestras en fresco71.

Actualmente, existen dos plataformas NAAT robóticas aprobadas por la FDA para la detección de TV en mujeres: estas incluyen el método Aptima TV (Hologic Gen-Probe)72 y el estudio ProbeTec Qx en el sistema BD Viper (Becton Dickinson)72.

Los estudios que utilizan el Trichomonas Aptima Combo 2 han demostrado un rendimiento superior en comparación con otros métodos. Esta prueba está aprobada para la detección de infecciones por TV de una amplia variedad de tipos de muestras, como muestras vaginales o endocervicales, muestras de citología de base líquida ThinPrep y muestras de orina.

Por otro lado, el BD TV Qx utiliza hisopos vaginales o endocervicales femeninos, así como una citología de orina y citologías de base líquida. Esta técnica ha demostrado una excelente sensibilidad y especificidad, y el tiempo de detección es inferior a 5h.

Otro método disponible fuera de los EE.UU. es el sistema de detección ACE Seeplex STD 6 (Seegene)73. Esta prueba es una PCR multiplex dirigida a genes únicos del patógeno específico.

Finalmente, el sistema BD MAXTM proporciona un estudio adecuado para ser utilizado con muestras de orina femenina y muestras de torunda vaginal o endocervical. Su uso en el estudio de muestras de orina masculina aún ha sido estudiado para la TV. Este método tiene una sensibilidad ≥91,5% y una especificidad ≥98,6%74.

Actualmente en el mercado existen más de 125 técnicas para la detección del VPH. Estas técnicas se pueden diferenciar en 4 tipos:

• -

  Técnicas de detección de ADN: el ADN del VPH se detecta tanto en la región de la cápside como en el oncogén E6.

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  Técnicas de detección de ARN: el ARNm se detecta a partir de los oncogenes VPH E6/7.

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  Técnicas de hibridación in situ: tienen baja sensibilidad y especificidad.

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  Técnicas serológicas: solo se utilizan con fines epidemiológicos y de eficacia vacunal.

Según la tecnología utilizada, los principales sistemas disponibles comercialmente se pueden clasificar de la siguiente manera:

• 1.

  Métodos de amplificación de señal: captura de híbridos de ARN-ADN e invasor químico.

• 2.

  Métodos de amplificación de ADN: PCR, PCR en tiempo real, PCR multiplex, amplificación mediada por transcripción (TMA), oligonucleótido de cebado doble (DPO) y la espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-TOF MS).

Fue el primer método aprobado por la FDA (marzo de 2003) para la detección de genotipos oncogénicos de VPH. Es un método de amplificación de señal de fase líquida/sólida basado en la hibridación en solución de sondas de ARN sintéticas largas complementarias a la secuencia genómica de 13 tipos de VPH de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) y 5 de bajo riesgo (6, 11, 42, 43 y 44). Los híbridos son detectados por algunas reacciones que generan una señal luminiscente que puede ser detectada por quimioluminiscencia. La principal limitación de este ensayo es que no discrimina el genotipo y la reactividad cruzada que puede conducir a resultados falsos positivos86.

Fue aprobado por la FDA en 2009. Este ensayo se basa en la tecnología Invader que consiste en reacciones isotérmicas concurrentes en dos partes. La reacción principal detecta la presencia de secuencias específicas de ADN viral, mientras que la segunda genera fluorescencia. Se puede detectar la presencia de cualquiera de los 14 genotipos de VPH de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68), pero no se puede realizar de forma individualizada. Sin embargo, Cervista HPV 16/18 identificará el VPH 16 y 18 de manera individual.

El sistema Cobas 4800 es un método automatizado que utiliza la muestra primaria obtenida para la citología en base líquida. Los resultados aparecen diferenciados en 4 canales: VPH 16, VPH 18, VPH de alto riesgo no 16/18 (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68) y β-globina (control interno). Las principales ventajas son la alta sensibilidad, la reproducibilidad y el alto grado de automatización.

Es un método que identifica la presencia de 14 genotipos de alto riesgo mediante la caracterización del ARNm viral de los oncogenes E6/7. La presencia de transcripciones de los oncogenes del VPH es el marcador más preciso y específico de infección o transformación celular por VPH de alto riesgo. Este método es útil para diferenciar entre transcripciones oncogénicas de VPH episomales e integradas, como en el cáncer cervical. Esta técnica consta de 3 pasos: captura, amplificación por sistema TMA y detección por hibridación87. Sin embargo, el principal problema con esta técnica es que el ARN es mucho más lábil que el ADN y está menos disponible en la mayoría de las muestras biológicas.

El reciente desarrollo en la combinación de sondas moleculares con chips de silicio puede conducir a un diagnóstico rápido y relativamente más económico. Esta tecnología requiere el uso de chips de silicio. La superficie del chip está cubierta con una fina capa de oro, y las sondas moleculares están unidas a la superficie del chip. Cada una de las sondas moleculares difiere en la diana de ADN para la que están diseñadas para hibridarse. Si se detecta la unión, la muestra se consideraría positiva para el VPH.

La mayoría de los estudios emplearon EIA, pero el principal problema con el uso de la serología es la estandarización y el establecimiento de un estándar internacional que asigne una unidad de medida o unidad internacional. Los estudios han demostrado que aproximadamente la mitad de las personas expuestas al VPH nunca desarrollarán títulos medibles de anticuerpos88.

La sobreexpresión de esta proteína se ha propuesto como marcador tisular para la infección por VPH de alto riesgo. La positividad de esta proteína aumenta con la gravedad de la lesión, y un alto porcentaje de muestras de citología HSIL son positivas. La sensibilidad de los ensayos de P16INK4a para detectar CIN3 es similar a los estudios de ADN del VPH, pero la especificidad necesita ser mejorada. Su papel como factor pronóstico molecular sigue siendo un tema pendiente de valoración89.